本发明公开一种枯草芽孢杆菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法,是以枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)GXA-28,保藏编号为CCTCCNO:M2012347的菌株通过菌种活化、保藏、种子液制备、液体摇瓶发酵、γ-聚谷氨酸提取纯化制备γ-聚谷氨酸。本发明可广泛使用廉价的碳氮源,例如糖蜜、无机铵盐,其中可将无机铵盐作为唯一氮源使用,在40~50°C的高温发酵条件下高效生产γ-聚谷氨酸,发酵时间18~25h,产量最高可达20~30g/l,生产速率可达0.9~1.3g/l?h,具有高效、低成本的优点。
1.一种枯草芽孢杆菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法,其特征在于包括如下步骤:(1)菌种活化、保藏将枯草芽孢杆菌(Bacillusxa0subtilis)GXA-28接于固体斜面培养基上,40~50°C培养8-16h,于2~8°C作短期保藏;所述枯草芽孢杆菌(Bacillusxa0subtilis)GXA-28的保藏编号为CCTCCxa0NO:Mxa02012347,保藏日期为2012年9月14日,保藏单位:中国典型培养物保藏中心;所述固体斜面培养基的浓度组成为:葡萄糖8~12g/l,酵母膏3~6g/l,谷氨酸钠3~6g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1~0.2g/l,KH₂PO₄xa00.3~0.5g/l,琼脂10~15g/l,pHxa0值6.5xa0~xa07.5,蒸馏水配制;(2)种子液制备将上述斜面上1.0cm²的菌株接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中,摇床转速160xa0~xa0250rpm,40xa0~xa050°C培养12xa0~xa024h至菌株对数生长中期;所述液体种子培养基浓度组成为:葡萄糖10xa0~xa050g/l,酵母膏2~xa010g/l,谷氨酸钠5xa0~xa020g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1xa0~xa00.5g/l,KH₂PO₄xa00.5xa0~xa02g/l,pHxa0值6.5xa0~xa07.5,蒸馏水配制;(3)液体摇瓶发酵将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中,接种量1~10%,摇瓶装液量20xa0~xa080ml/250ml,xa0摇床转速160xa0~xa0250rpm,40xa0~xa050°C培养18xa0~xa025h;所述液体发酵培养基浓度组成为:碳源10xa0~xa0100g/l,氮源2~xa020g/l,谷氨酸钠10xa0~xa0100g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1xa0~xa01g/l,KH₂PO₄xa00.5xa0~xa05g/l,pHxa0值6.5xa0~xa07.5,蒸馏水配制;(4)γ-聚谷氨酸提取纯化收集成熟的发酵液,加入3xa0~xa05倍体积蒸馏水稀释,利用孔径为0.22xa0~xa00.45μm微滤膜去除菌体,上清液采用截留分子量为50xa0~xa0100KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的30xa0~xa050%,加入2xa0~xa04倍体积的工业级乙醇进行沉淀,收集沉淀,冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法,其特征在于:所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖和糖蜜中的任意一种或几种混合物。
3.根据权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法,其特征在于:所述氮源为酵母膏、玉米浆、尿素、NaNO₃、NH₄Cl和(NH₄)₂SO₄中的任意一种或几种混合物。技术领域
本发明属于微生物发酵领域,特别涉及到一种枯草芽孢杆菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸(Poly(γ-glutamicxa0acid),γ-PGA)是由L-谷氨酸和D-谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基聚合而成的一种独特的生物高分子。1937年由Ivánovics等人首先在炭疽芽胞杆菌荚膜中发现(Ivánovicsxa0andxa0Brucknerxa01937;Ivánovicsxa0andxa0Erdōs1937);并在1942年被证实可作为发酵产物由枯草芽孢杆菌分泌至液体培养基中(Bovamick1942)。由此,枯草芽孢杆菌和地衣芽胞杆菌被作为主要的γ-聚谷氨酸产生菌引起了广泛的研究。γ-聚谷氨酸通常是由500-5000个谷氨酸单体聚合而成,分子量在100-1000kDa之间。γ-聚谷氨酸分子中的谷氨酸残基上带有大量游离的亲水性羧基,可在分子内部或分子间形成氢键,具有极高的水溶性和吸水保湿性;这些游离羧基同时提供了阳离子结合的基团,使其对金属离子具有良好的吸附性。除此之外,γ-聚谷氨酸作为一种环境友好型生物高分子,还具有一些独特的优良特性,如可食用、可降解、生物兼容性、对人体和环境无毒害等。因此,其被作为冷冻保护剂、祛苦剂、增稠剂和矿物质吸附剂应用于食品领域;作为药物输送剂、基因载体、医用生物粘合剂应用于医药领域;作为热塑性材料、水凝胶等应用于工业和农业领域;作为金属吸附剂和生物絮凝剂应用于环保领域;作为保湿剂应用于化妆品领域。γ-聚谷氨酸制备方法主要有化学合成法、酶转化法和微生物发酵法。化学合成法过程复杂、收率低,工业应用价值不大;酶转化法,由于酶促反应所需的谷氨酰转肽酶在生物体内含量和活力较低,且分离纯化困难,因此制约了酶转化法的发展和应用。微生物合成法由于发酵过程容易控制、产量稳定、提取工艺简单、提取率高以及便于大规模生产等优点,已逐渐成为γ-聚谷氨酸的主要生产方法。尤其是近十年来,国内外对微生物发酵生产γ-聚谷氨酸进行了广泛深入地研究。目前,日本和韩国已进行了工业化试生产。国内开展γ-聚谷氨酸的研究相对较晚,一些科研院校主要对γ-聚谷氨酸产生菌筛选、发酵工艺优化、分批发酵生产等进行了研究,取得了一些可喜的研究成果。γ-聚谷氨酸经过近二十年的研究和发展,菌种的发酵生产能力得到了较大幅度的提高,关于γ-聚谷氨酸的生产工艺研究,我们查到以下公开文献:1.申请号:01127287.2,发明名称:γ-聚谷氨酸及其盐的制备方法,通过采用芽孢杆菌属菌株,如枯草芽孢杆菌,地衣芽胞杆菌,在37°C,含碳源、氮源、谷氨酸培养基上培养,生成高活力的γ-谷氨酰转肽酶,酶活力为1-10U/ml,从而可生成高浓度的γ-聚谷氨酸发酵液,进而用溶剂沉淀或化学沉淀法得γ-聚谷氨酸或其盐。2.申请号:02151746.0,发明名称:利用枯草芽孢杆菌NX-2制备γ-聚谷氨酸及其盐和谷胱甘肽及其前体,是将枯草芽孢杆菌NX-2在30~37°C,含谷氨酸的培养基中培养,在优化条件下能积累30~50g/lγ-聚谷氨酸,生产效率高达0.8~2.5g·h^-1·l^-1。3.申请号:200410010509.0,发明名称:枯草芽孢杆菌及其用于制备γ-聚谷氨酸的方法,是将CGMCCxa0No.1250,在20~40°C,含有碳源、氮源、谷氨酸、MgSO₄、NaCl和K₂HPO₄的培养基中培养,得到发酵液,再将发酵液通过有机溶剂沉淀、透析,得到γ-聚谷氨酸产品。该方法工艺简单,高效价廉,产量高。4.申请号:200710130248.X,发明名称:一株γ-聚谷氨酸的菌株及其培养方法,是将CGMCCxa0No.2108,在37°C,含有葡萄糖、酵母膏、谷氨酸钠、MgSO₄和K₂HPO₄的培养基中培养,得到发酵液。该方法简便易行,所用培养基的原料来源广泛,价格低廉,有效降低了生产成本,适合大规模的工业化生产。5.申请号:200810027184.5,发明名称:一种γ-聚谷氨酸的制备方法,是用枯草芽孢杆菌(Bacillusxa0subtilis)PGA-7CCTCCxa0M206102做发酵菌株对发酵培养基进行摇瓶发酵以制备γ-聚谷氨酸,其工艺过程包括斜面菌种活化、菌种的液体活化、摇瓶发酵和摇瓶发酵醪液提取,发酵温度为32~37°C。该发明采用由多种有机氮源和无机氮源相组合的优选的发酵原料,在最佳摇瓶发酵工艺条件下,产γ-聚谷氨酸最高可达27.3g/l,具有良好的工业化应用前景。6.申请号:200810150830.7,发明名称:枯草芽孢杆菌及用该菌株制备γ-聚谷氨酸的方法,是将编号为CCTCCxa0NO:M208044的菌株通过菌种培养保藏、制备种子液、摇瓶液体发酵以及提取γ-聚谷氨酸步骤制备γ-聚谷氨酸,其发酵温度为30~40°C,发酵时间12~48小时。该方法可在低成本的液体培养基中高效合成γ-聚谷氨酸,且方法简单,可操作性强。7.申请号:201010271196.X,发明名称:一株γ-聚谷氨酸产生菌及利用其制备γ-聚谷氨酸及其盐的方法,是将编号为CGMCCxa0No.4034的菌株通过种子培养、发酵培养、γ-聚谷氨酸的提取步骤制备γ-聚谷氨酸,其发酵温度为30~37°C,发酵时间24~72小时。该发明合成的γ-聚谷氨酸分子量较低(300~400KDa),分子量分布较窄,可适用于低分子量要求的应用领域。上述查到的专利,存在以下不足之处:其发酵温度必须严格的控制在40°C以下、发酵条件要求高、发酵培养基成分复杂、发酵工艺成本高、发酵周期长、生产效率低等,严重制约了γ-聚谷氨酸发酵工业化的进程。因此,寻找高效、低成本的发酵工艺条件生产γ-聚谷氨酸具有重要的生产意义。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足,提供一种枯草芽孢杆菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法,本方法是以枯草芽孢杆菌(Bacillusxa0subtilis)GXA-28,保藏编号CCTCCxa0NO:Mxa02012347为出发菌株,可广泛使用廉价的碳氮源,例如糖蜜、无机铵盐,其中可将无机铵盐作为唯一氮源使用,在40~50°C的高温发酵条件下高效生产γ-聚谷氨酸,发酵时间18~25h,产量最高可达20~30g/l,生产速率可达0.9~1.3g/l·h,具有高效、低成本的优点。为了实现上述目的,本发明是通过以下技术方案实现的:一种枯草芽孢杆菌高温发酵生产γ-聚谷氨酸的方法,包括如下步骤:(1)菌种活化、保藏将枯草芽孢杆菌(Bacillusxa0subtilis)GXA-28接于固体斜面培养基上,40~50°C培养8-16h,于2~8°C作短期保藏;所述枯草芽孢杆菌(Bacillusxa0subtilis)GXA-28的保藏编号为CCTCCxa0NO:Mxa02012347,保藏日期为2012年9月14日,保藏单位:中国典型培养物保藏中心;所述固体斜面培养基的浓度组成为:葡萄糖8~12g/l,酵母膏3~6g/l,谷氨酸钠3~6g/l,MgSO₄·7H₂O0.1~0.2g/l,KH₂PO₄0.3~0.5g/l,琼脂10~15g/l,pH值6.5~7.5,蒸馏水配制;(2)种子液制备将上述斜面上1.0cm²的菌株接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中,摇床转速160~250rpm,40~50°C培养12~24h至菌株对数生长中期;所述液体种子培养基浓度组成为:葡萄糖10~50g/l,酵母膏2~10g/l,谷氨酸钠5~20g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1~0.5g/l,KH₂PO₄0.5~2g/l,pH值6.5~7.5,蒸馏水配制;(3)液体摇瓶发酵将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中,接种量1~10%,摇瓶装液量20~80ml/250ml,摇床转速160~250rpm,40~50°C培养18~25h;所述液体发酵培养基浓度组成为:碳源10~100g/l,氮源2~20g/l,谷氨酸钠10~100g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1~1g/l,KH₂PO₄xa00.5~5g/l,pH值6.5~7.5,蒸馏水配制;(4)γ-聚谷氨酸提取纯化收集成熟的发酵液,加入3~5倍体积蒸馏水稀释,利用孔径为0.22~0.45μm微滤膜去除菌体,上清液采用截留分子量为50~100KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的30~50%,加入2~4倍体积的工业级乙醇进行沉淀,收集沉淀,冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。以上所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖和糖蜜中的任意一种或几种混合物。以上所述氮源为酵母膏、玉米浆、尿素、NaNO₃、NH₄Cl和(NH₄)₂SO₄中的任意一种或几种混合物。本发明所获得的γ-聚谷氨酸产品理化性质表征如下:(1)本发明产品易溶于水,不溶于甲醇、乙醇或丙酮等有机溶剂;(2)本发明产品茚三酮显色反应呈阴性,盐酸水解产物茚三酮反应呈阳性;盐酸完全水解产物经薄层层析分析,氨基酸组分只有谷氨酸;上述说明本产品为谷氨酸的均聚物;(3)本发明产品在216nm下具有特征吸收峰,在280nm下无吸收峰;缩二脲显色反应呈阴性;上述说明本产品没有典型的肽链结构;(4)本发明产品经核磁共振(¹H-NMR)和红外光谱检测,图谱结果显示与γ-聚谷氨酸标准品结构相符。与现有技术相比,本发明的有益效果是:1.本发明以枯草芽孢杆菌(Bacillusxa0subtilis)GXA-28为出发菌株,可在40~50°C的高温发酵条件下高效生产γ-聚谷氨酸,发酵时间18~25h,产量最高可达20~30g/l,生产速率可达0.9~1.3g/l·h,这些优良特性为工业化生产提供了有利条件。2.本发明可广泛使用廉价的碳氮源,例如糖蜜、无机铵盐,其中可将无机铵盐作为唯一氮源使用,这些廉价原料可以满足工业化生产的要求。
附图说明
图1为γ-聚谷氨酸标准品的核磁共振(¹H-NMR)图;图2为本发明的产品γ-聚谷氨酸的核磁共振(¹H-NMR)图;图3为γ-聚谷氨酸标准品的红外谱图;图4为本发明的产品γ-聚谷氨酸的红外谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围,本发明所利用的出发菌株枯草芽孢杆菌(Bacillusxa0subtilis)GXA-28,保藏编号为CCTCCxa0NO:M2012347,保藏日期为2012年9月14日,保藏单位:中国典型培养物保藏中心;以下称为CCTCCxa0NO:M2012347。实施例1~5:(1)菌种活化、保藏:将CCTCCxa0NO:M2012347接于固体斜面培养基上,45°C培养16h,于4°C作短期保藏;固体斜面培养基的浓度组成为:葡萄糖10g/l,酵母膏5g/l,谷氨酸钠5g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,琼脂15g/l,pH值7.0,蒸馏水配制;(2)种子液制备:将上述斜面上1.0cm²的菌株接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中,摇床转速180rpm,45°C培养12h至菌株对数生长中期;液体种子培养基浓度组成为:葡萄糖10g/l,酵母膏5g/l,谷氨酸钠5g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,pH值7.0,蒸馏水配制;(3)液体摇瓶发酵:将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中,接种量2%(v/v),摇瓶装液量50ml/250ml,摇床转速180rpm,45°C培养22h;其中所述液体发酵培养基浓度组分为:碳源30g/l,酵母膏2.5g/l,谷氨酸钠30g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.2g/l,KH₂PO₄xa01g/l,pH值7.0,蒸馏水配制。(4)γ-聚谷氨酸提取纯化:收集成熟的发酵液,加入4倍体积蒸馏水稀释,利用孔径为0.45μm微滤膜去除菌体,上清液采用截留分子量为100KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的30%,加入3倍体积的工业级乙醇进行沉淀,收集沉淀,冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。其中所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖和糖蜜,按上述方法经摇瓶发酵后,分析所得发酵液中γ-聚谷氨酸含量如下表1所示。表1 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 实施例6~12:(1)菌种活化、保藏:将CCTCCxa0NO:M2012347接于固体斜面培养基上,45°C培养16h,于4°C作短期保藏;固体斜面培养基的浓度组成为:葡萄糖10g/l,酵母膏5g/l,谷氨酸钠5g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,琼脂15g/l,pH值7.0,蒸馏水配制;(2)种子液制备:将上述斜面上1.0cm²的菌株接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中,摇床转速180rpm,45°C培养12h至菌株对数生长中期;液体种子培养基浓度组成为:葡萄糖10g/l,酵母膏5g/l,谷氨酸钠5g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,pH值7.0,蒸馏水配制;(3)液体摇瓶发酵:将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中,接种量2%(v/v),摇瓶装液量50ml/250ml,摇床转速180rpm,45°C培养22h;其中液体发酵培养基浓度组分为:葡萄糖30g/l,氮源2.5g/l,谷氨酸钠30g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.2g/l,KH₂PO₄xa01g/l,pH7.0,蒸馏水配制。(4)γ-聚谷氨酸提取纯化:收集成熟的发酵液,加入4倍体积蒸馏水稀释,利用孔径为0.45μm微滤膜去除菌体,上清液采用截留分子量为100KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的30%,加入3倍体积的工业级乙醇进行沉淀,收集沉淀,冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。其中所述氮源为酵母膏、玉米浆、尿素、NaNO₃、NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄、酵母膏+NH₄Cl(质量比1:4),按上述方法经摇瓶发酵后,分析所得发酵液中γ-聚谷氨酸含量如下表2所示。表2 ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/> 实施例13(1)菌种活化:将CCTCCxa0M2012347接于固体斜面培养基上,45°C培养16h,于4°C作短期保藏;固体斜面培养基的浓度组成为:葡萄糖10g/l,酵母膏5g/l,谷氨酸钠5g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,琼脂15g/l,pH值6.5,蒸馏水配制;(2)种子液制备:将上述斜面上1.0cm²的菌苔接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中,摇床转速180rpm,45°C培养12h至菌株对数生长中期;其中所述液体种子培养基浓度组分为:葡萄糖10g/l,酵母膏5g/l,谷氨酸钠5g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,pH7.0,蒸馏水配制。(3)液体摇瓶发酵:将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中,接种量2%(v/v),摇瓶装液量50ml/250ml,摇床转速180rpm,50°C培养22h;其中液体发酵培养基浓度组分为:葡萄糖30g/l,酵母膏2.5g/l,谷氨酸钠20g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,pH7.0,蒸馏水配制。(4)γ-聚谷氨酸提取纯化:收集成熟的发酵液,加入4倍体积蒸馏水稀释,利用孔径为0.45μm微滤膜去除菌体,上清液采用截留分子量为100KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的30%,加入3倍体积的工业级乙醇进行沉淀,收集沉淀,冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。取适量成品准确称取其重量,换算成发酵液中γ-聚谷氨酸含量为17.3±1.1g/l。实施例14:(1)菌种活化:将CCTCCxa0M2012347接于固体斜面培养基上,45°C培养16h,于4°C作短期保藏;固体斜面培养基的浓度组成为:葡萄糖10g/l,酵母膏5g/l,谷氨酸钠5g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,琼脂15g/l,pH值7.5,蒸馏水配制;(2)种子液制备:将上述斜面上1.0cm²的菌苔接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中,摇床转速180rpm,45°C培养12h至菌株对数生长中期;其中所述液体种子培养基浓度组分为:葡萄糖10g/l,酵母膏5g/l,谷氨酸钠5g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,pH7.0,蒸馏水配制。(3)液体摇瓶发酵:将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中,接种量2%(v/v),摇瓶装液量50ml/250ml,摇床转速180rpm,45°C培养22h;其中液体发酵培养基浓度组分为:葡萄糖30g/l,酵母膏2.5g/l,谷氨酸钠20g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,pH7.0,蒸馏水配制。(4)γ-聚谷氨酸提取纯化:收集成熟的发酵液,加入4倍体积蒸馏水稀释,利用孔径为0.45μm微滤膜去除菌体,上清液采用截留分子量为100KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的30%,加入3倍体积的工业级乙醇进行沉淀,收集沉淀,冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。取适量成品准确称取其重量,换算成发酵液中γ-聚谷氨酸含量为19.9±1.3g/l。实施例15:(1)菌种活化:将CCTCCxa0M2012347接于固体斜面培养基上,45°C培养16h,于4°C作短期保藏;固体斜面培养基的浓度组成为:葡萄糖10g/l,酵母膏5g/l,谷氨酸钠5g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,琼脂15g/l,pH值7.0,蒸馏水配制;(2)种子液制备:将上述斜面上1.0cm²的菌苔接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中,摇床转速180rpm,45°C培养12h至菌株对数生长中期;其中所述液体种子培养基浓度组分为:葡萄糖10g/l,酵母膏5g/l,谷氨酸钠5g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,pH7.0,蒸馏水配制。(3)液体摇瓶发酵:将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中,接种量5%(v/v),摇瓶装液量50ml/250ml,摇床转速180rpm,45°C培养22h;其中所述液体发酵培养基浓度组分为:葡萄糖40g/l,酵母膏2.5g/l,谷氨酸钠40g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.2g/l,KH₂PO₄xa01g/l,pH7.0,蒸馏水配制。(4)γ-聚谷氨酸提取纯化:收集成熟的发酵液,加入4倍体积蒸馏水稀释,利用孔径为0.45μm微滤膜去除菌体,上清液采用截留分子量为100KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的30%,加入3倍体积的工业级乙醇进行沉淀,收集沉淀,冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。取适量成品准确称取其重量,换算成发酵液中γ-聚谷氨酸含量为33.6±1.5g/l。实施例16:与实施例15的不同之处在于:(3)液体摇瓶发酵:将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中,接种量5%(v/v),摇瓶装液量50ml/250ml,摇床转速180rpm,42°C培养22h;取适量成品准确称取其重量,换算成发酵液中γ-聚谷氨酸含量为28.9±1.3g/l。其余步骤与实施例15相同。实施例17:(1)菌种活化:将CCTCCxa0M2012347接于固体斜面培养基上,40°C培养8h,于2°C作短期保藏;固体斜面培养基的浓度组成为:葡萄糖8g/l,酵母膏3g/l,谷氨酸钠3g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.2g/l,KH₂PO₄xa00.3g/l,琼脂10g/l,pH值6.5,蒸馏水配制;(2)种子液制备:将上述斜面上1.0cm²的菌苔接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中,摇床转速160rpm,40°C培养24h至菌株对数生长中期;其中所述液体种子培养基浓度组分为:葡萄糖20g/l,酵母膏10g/l,谷氨酸钠10g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.2g/l,KH₂PO₄xa01g/l,pH6.5,蒸馏水配制。(3)液体摇瓶发酵:将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中,接种量8%(v/v),摇瓶装液量20ml/250ml,摇床转速160rpm,40°C培养25h;其中液体发酵培养基浓度组分为:葡萄糖10g/l,酵母膏2g/l,谷氨酸钠10g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.2g/l,KH₂PO₄xa02g/l,pH6.5,蒸馏水配制。(4)γ-聚谷氨酸提取纯化:收集成熟的发酵液,加入3倍体积蒸馏水稀释,利用孔径为0.22μm微滤膜去除菌体,上清液采用截留分子量为50KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的40%,加入2倍体积的工业级乙醇进行沉淀,收集沉淀,冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。取适量成品准确称取其重量,换算成发酵液中γ-聚谷氨酸含量为8.5±0.7g/l。实施例18:(1)菌种活化:将CCTCCxa0M2012347接于固体斜面培养基上,50°C培养10h,于8°C作短期保藏;固体斜面培养基的浓度组成为:葡萄糖12g/l,酵母膏6g/l,谷氨酸钠6g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.4g/l,琼脂12g/l,pH值7.5,蒸馏水配制;(2)种子液制备:将上述斜面上1.0cm²的菌苔接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中,摇床转速250rpm,50°C培养18h至菌株对数生长中期;其中所述液体种子培养基浓度组分为:葡萄糖50g/l,酵母膏2g/l,谷氨酸钠20g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.5g/l,KH₂PO₄xa02g/l,pH7.5,蒸馏水配制。(3)液体摇瓶发酵:将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中,接种量10%(v/v),摇瓶装液量80ml/250ml,摇床转速250rpm,50°C培养18h;其中液体发酵培养基浓度组分为:葡萄糖100g/l,酵母膏20g/l,谷氨酸钠100g/l,MgSO₄·7H₂Oxa01g/l,KH₂PO₄xa05g/l,pH7.5,蒸馏水配制。(4)γ-聚谷氨酸提取纯化:收集成熟的发酵液,加入5倍体积蒸馏水稀释,利用孔径为0.40μm微滤膜去除菌体,上清液采用截留分子量为80KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的50%,加入4倍体积的工业级乙醇进行沉淀,收集沉淀,冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。取适量成品准确称取其重量,换算成发酵液中γ-聚谷氨酸含量为30.6±1.2g/l。